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https://tede2.pucrs.br/tede2/handle/tede/9116
Tipo do documento: | Dissertação |
Título: | Validação da enzima 5-enolpiruvilchiquimato-3-fosfato sintase (EPSP sintase) de Mycobacterium smegmatis como alvo molecular para desenvolvimento de novas moléculas antimicobacterianas |
Autor: | Villegas, Mario Alejandro Duque |
Primeiro orientador: | Bizarro, Cristiano Valim |
Primeiro coorientador: | Abbadi, Bruno Lopes |
Resumo: | A importância epidemiológica das bactérias do gênero Mycobacterium é indiscutível e a necessidade de encontrar novas moléculas que possam inibir o seu crescimento é urgente. A via do chiquimato, necessária para a síntese de importantes metabolitos em bactérias, representa um alvo para inibidores do crescimento da Mycobacterium tuberculosis. O gene aroA codifica a enzima 5-enolpiruvilchiquimato-3-fosfato sintase (EPSPS) que catalisa a sexta etapa da via do chiquimato. Neste estudo, combinamos nocaute de genes, e ensaios cinéticos para avaliar a essencialidade do gene aroA e experimentos de silenciamento gênico para avaliar a vulnerabilidade de seu produto protéico, EPSPS synthase de Mycobacterium smegmatis (MsEPSPS), sob diferentes condições nutricionais. Demonstramos através de uma abordagem de nocaute gênico baseada na troca alélica, a essencialidade do MsEPSPS sob condições nutricionais ricas e pobres. Ao realizar experimentos de complementação gênica com o tipo selvagem (WT) e versões mutantes pontuais do gene aroA, juntamente com ensaios cinéticos usando WT e proteínas recombinantes mutantes, demonstramos que a essencialidade do gene aroA depende da atividade da MsEPSPS. Para avaliar a vulnerabilidade da MsEPSPS, realizamos experimentos de silenciamento genico usando o sistema Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats Interaction (CRISPRi). Os experimentos foram realizados tanto em meios ricos como definidos (pobres), usando três forças de repressão diferentes para o gene aroA. Apenas observamos um défice no crescimento quando as bactérias foram cultivadas em meios definidos sem suplementação de aminoácidos aromáticos, indicando assim que a vulnerabilidade do MsEPSPS depende das condições ambientais. |
Abstract: | The epidemiological importance of bacteria from the genus Mycobacterium is indisputable and the necessity to find new molecules that can inhibit their growth is urgent. The shikimate pathway, required for the synthesis of important metabolites in bacteria, represents a target for inhibitors of Mycobacterium tuberculosis growth. The aroA-encoded 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase (EPSPS) enzyme catalyzes the sixth step of the shikimate pathway. In this study, we combined gene knockout, gene knockdown and kinetic assays to evaluate aroA gene essentiality and the vulnerability of its protein product, EPSPS synthase from Mycobacterium smegmatis (MsEPSPS), under different nutritional conditions. We demonstrate by an allelic exchange-based gene knockout approach the essentiality of MsEPSPS under rich and poor nutritional conditions. By performing gene complementation experiments with wild-type (WT) and point mutant versions of aroA gene, together with kinetic assays using WT and mutant recombinant proteins, we show that aroA gene essentiality depends on MsEPSPS activity. To evaluate MsEPSPS vulnerability, we performed gene knockdown experiments using the Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats interference (CRISPRi) system. The experiments were performed in both rich and defined (poor) media, using three different repression forces for aroA gene. We only observed growth impairment when bacteria were grown in defined medium without supplementation of aromatic amino acids, thereby indicating that MsEPSPS vulnerability depends on the environment conditions. |
Palavras-chave: | Mycobacterium Smegmatis MsEPSPS Vulneirabilidade CRISPRi |
Área(s) do CNPq: | CIENCIAS BIOLOGICAS::BIOLOGIA GERAL |
Idioma: | por |
País: | Brasil |
Instituição: | Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul |
Sigla da instituição: | PUCRS |
Departamento: | Escola de Ciências |
Programa: | Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular |
Tipo de acesso: | Acesso Aberto |
Restrição de acesso: | Trabalho será publicado como artigo ou livro |
Prazo para liberar texto completo: | 60 meses |
Data para liberar texto completo: | 05/06/2025 |
URI: | http://tede2.pucrs.br/tede2/handle/tede/9116 |
Data de defesa: | 4-Mar-2020 |
Aparece nas coleções: | Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular |
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