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Document type: Dissertação
Title: Participação do vírus sincicial respiratório, das espécies reativas de oxigênio e da autofagia na formação de redes extracelulares de eosinófilos na asma
Author: Silveira, Josiane Silva 
Advisor: Cunha, Aline Andrea da
Abstract (native): INTRODUÇÃO: a asma é uma doença inflamatória crônica caracterizada pela secreção de elevados níveis de citocinas do perfil T helper 2 (Th2) como interleucina (IL)-4, IL-5 e IL-13, espécies reativas de oxigênio (EROs), aumento da autofagia e formação redes extracelulares de eosinófilos (EETs). A infecção pelo vírus sincicial respiratório (VSR) pode facilitar o desenvolvimento da sensibilização alérgica bem como exacerbar os sintomas da doença. Recentemente, estudos têm demonstrado o aumento da autofagia em eosinófilos das vias de pacientes asmáticos, contribuindo para o aumento da resposta inflamatória nas vias aéreas. Na asma, a produção excessiva de EETs pode causar dano tecidual e aumento da viscosidade do muco, podendo contribuir para o aumento da obstrução da via aérea e redução da função pulmonar. Entretanto, os mecanismos de formação das EETs e seu papel fisiopatológico na asma são pouco compreendidos. OBJETIVO: esta dissertação teve como objetivo elucidar alguns mecanismos envolvidos na liberação de EETs na asma. Avaliamos a participação do VSR in vitro, das EROs e da autofagia nos mecanismos envolvidos na liberação das EETs em eosinófilos do lavado broncoalveolar (LBA) em um modelo experimental de asma. METODOLOGIA: para o desenvolvimento do modelo experimental de asma, camundongos BALB/cJ foram sensibilizados com duas injeções subcutâneas de ovalbumina (OVA) nos dias 0 e 7 seguidos por três desafios intranasais com OVA nos dias 14, 15 e 16 do protocolo. No artigo científico 1, eosinófilos do LBA de animais do grupo OVA e do grupo controle foram estimulados com VSR (103 PFU/mL) in vitro por 3 horas. Após este período, o sobrenadante da cultura foi coletado para a realização das técnicas avaliadas conforme os objetivos específicos deste artigo científico. No artigo cientifico 2, durante o protocolo experimental de asma, os animais foram tratados via intranasal com um inibidor da nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato oxidase (NADPH oxidase), difenileno-iodônio (DPI), ou com um precursor da glutationa, N-acetilcisteína (NAC), 45 minutos antes dos três desafios intranasais com OVA. Já no artigo cientifico 3, os animais foram tratados via intranasal com um inibidor de autofagia, 3-metiladenina (3-MA), 45 minutos antes dos três desafios intranasais com OVA. Ao final do protocolo o LBA e o tecido pulmonar foram coletados para a realização das técnicas avaliadas em cada um dos artigos científicos, conforme seus objetivos específicos. RESULTADOS: no artigo cientifico 1, observamos um aumento na liberação de EETs em eosinófilos do LBA de animais submetidos ao modelo experimental de asma e estimulados com VSR in vitro. Por outro lado, o VSR in vitro foi capaz de diminuir os níveis de IFN-γ no sobrenadante da cultura de eosinófilos do LBA. Em relação aos resultados do artigo científico 2, verificamos que no grupo OVA tratado com NAC ocorreu uma diminuição no número de células inflamatórias no LBA bem como uma redução no infiltrado inflamatório pulmonar. Além disso, os animais do grupo OVAM tratados com DPI ou NAC apresentaram uma redução da enzima EPO, hiperplasia de células caliciformes, citocinas inflamatórias e da proteína fator nuclear kappa B (NFĸB p65). Os tratamentos com DPI ou NAC foram capazes de reduzir a formação de EROs, aumentar a atividade da enzima catalase antixidante (CAT). Por outro lado, parâmetros do metabolismo energético mitocondrial aumentaram somente com o tratamento com NAC. Por fim, demonstramos que os tratamentos com DPI ou NAC foram capazes de reduzir a formação de EETs do LBA. No artigo científico 3, observamos que no grupo OVA tratado com o inibidor de autofagia, 3-MA, ocorreu uma diminuição no número de células inflamatórias no LBA bem como uma redução do infiltrado inflamatório pulmonar. Além disso, os animais tratados com 3-MA apresentaram uma redução nos níveis da enzima EPO, hiperplasia de células caliciformes, citocinas inflamatórias e da proteína NFĸB p65. O tratamento com 3-MA foi capaz de reduzir a formação de EROs bem como aumentar os níveis da enzima antioxidante CAT. O tratamento com 3-MA também melhorou parâmetros do metabolismo energético mitocondrial e a atividade da enzima Na+,K+ATPase. Demonstramos também que o tratamento com 3-MA diminuiu o imunoconteúdo da proteína light chain 3B (LC3B) em eosinófilos do LBA e no tecido pulmonar e reduziu a formação de EETs no LBA. CONCLUSÃO: Nossos resultados demonstram um importante papel do VSR na indução da liberação de EETs. Além disso, verificamos que os tratamentos com DPI, NAC e 3-MA foram capazes de reduzir a inflamação das vias aéreas, o estresse oxidativo e a liberação de EETs no LBA. Demonstramos que o VSR, as EROs e a autofagia participam dos mecanismos que regulam o processo de liberação das EETs na asma. Assim, a identificação de alguns desses mecanismos envolvidos na liberação de EETs na asma pode contribuir para uma melhor compreensão da patogênese desta doença inflamatória crônica que prejudica a qualidade de vida dos pacientes e é responsável por um alto custo econômico para o Sistema Único de Saúde (SUS).
Abstract (english): INTRODUCTION: asthma is a chronic inflammatory disease characterized by secretion of elevated levels of cytokines (interleukin (IL)-4, IL-5 and IL-13), reactive oxygen species (ROS), autophagy and eosinophil extracellular traps (EETs) release in airway. Moreover, respiratory syncytial virus (RSV) infection may facilitate allergic sensitization development as well as exacerbate asthma symptoms. Recently, studies have demonstrated an increase of autophagy in eosinophils of asthmatic patients, contributing to an increase in inflammatory response. In asthma, an increase in EETs release may cause tissue damage and an increase in mucus viscosity, which contribute to airway obstruction and reduction of lung function. However, the mechanism of EETs formation and its pathophysiologic role in asthma are poorly understood. OBJECTIVE: the aim of this dissertation was to elucidate some mechanisms involved in EETs release in asthma. We investigated whether the respiratory syncytial virus (RSV) could induce EETs in vitro in bronchoalveolar lavage fluid (BALF) eosinophils of an experimental asthma model. Moreover, we evaluated ROS and autophagy participation in mechanisms involved in EETs formation. METHODS: in order to perform the experimental model of asthma, BALB/cJ mice were sensitized with two subcutaneous injections of ovalbumin (OVA) on days 0 and 7, followed by three intranasal challenges with OVA on days 14, 15 and 16 of the protocol. In paper 1, BALF eosinophils of OVA group and control group were stimulated with RSV (103 PFU/mL) in vitro for 3 hours. After that, culture supernatant was collected in order to perform the analyses proposed in this study which were evaluated according to the specific objectives of this paper. In paper 2, during the experimental asthma protocol, mice were treated intranasally with a nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase (NDPH oxidase) inhibitor, diphenyleneiodonium (DPI), or a glutathione precursor, N-acetylcysteine (NAC). In paper 3, mice were treated intranasally with an autophagy inhibitor, 3-Methyladenine (3-MA). Treatments were performed 45 minutes before of the three intranasal administrations with OVA. At the end of the protocol, BALF and lung tissue were collected to perform the techniques discribed in each of the papers, according to their specific objectives. RESULTS: in paper 1, we verified an increase in EETs release in BALF eosinophils from OVA group stimulated with RSV in vitro. RSV in vitro decreased IFN-γ in BALF cells when compared to the OVA group. In paper 2, we showed that in NAC-treated OVA group there was a decrease in the inflammatory cells in BALF and lung tissue. DPI or NAC treatments reduced EPO activity, goblet cells hyperplasia, inflammatory cytokines and NFĸB p65 immunocontent in lung, and they helped in decreasing ROS production in lung. Furthermore, NAC increased catalase (CAT) activity in lung. However, only NAC treatment improved mitochondrial energy metabolism in lung. We showed that DPI or NAC reduced EETs formation in BALF from the OVA group. In paper 3, we showed that in 3-MA-treated OVA group there was a decrease in the inflammatory cells, EPO activity, goblet cells hyperplasia, inflammatory cytokines, NFκB p65 immunocontent, and oxidative stress in airway. Moreover, 3-MA was able to improve mitochondrial energy metabolism and increase Na+,K+-ATPase activity. We also demonstrated that 3-MA decreased light chain 3B (LC3B) in BALF cells and lung tissue as well as reduced EETs formation in BALF. CONCLUSION: our results verified an important role for RSV in the induction of EETs release. Moreover, DPI, NAC and 3-MA treatments decreased airway inflammation, oxidative stress and EETs release in asthma. Our data suggested that RSV, ROS and autophagy participate in the mechanisms for EETs release in asthma. Thus, identification of mechanisms that regulate EETs formation in asthma may contribute to a better understanding of the pathogenesis of this chronic inflammatory disease which damages patients’ quality of life and is responsible for a high economic cost for the Brazilian Single Health System (SUS).
Keywords: Asma
Autofagia
Espécies Reativas de Oxigênio
Redes Extracelulares de Eosinófilos
Vírus Sincicial Respiratório
Asthma
Autophagy
Eosinophil Extracellular Traps
Reactive Oxygen Species
Respiratory Syncytial Virus
CNPQ Knowledge Areas: CIENCIAS DA SAUDE::MEDICINA
Language: por
Country: Brasil
Publisher: Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul
Institution Acronym: PUCRS
Department: Escola de Medicina
Program: Programa de Pós-Graduação em Medicina/Pediatria e Saúde da Criança
Access type: Acesso Aberto
Fulltext access restriction: Trabalho será publicado como artigo ou livro
Time to release fulltext: 60 meses
Date to release fulltext: 05/11/2023
URI: http://tede2.pucrs.br/tede2/handle/tede/8342
Issue Date: 26-Oct-2018
Appears in Collections:Programa de Pós-Graduação em Pediatria e Saúde da Criança

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