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Please use this identifier to cite or link to this item: https://tede2.pucrs.br/tede2/handle/tede/7457
Document type: Tese
Title: Estudos sobre a especificidade de antígenos e sua aplicabilidade para o imunodiagnóstico das angiostronilíases
Other Titles: Study of antigens specificity and its application for the immunodiagnosis of angiostrongyliasis
Author: Cognato, Bianca Barbieri 
Advisor: Graeff-Teixeira, Carlos
Abstract (native): Duas espécies de nematódeos pertencentes a superfamília Metastrongyloidea, são capazes de produzir doença em humanos: Angiostrongylus cantonensis e Angiostrongylus costaricensis. Ambos são parasitas próprios de roedores e a infecção humana é considerada acidental. A meningite eosinofílica, causada por A. cantonensis, tem gerado preocupação na comunidade científica pela expansão da área geográfica de ocorrência. Métodos moleculares e imunológicos para o diagnóstico desta infecção são cruciais para o diagnóstico, entretanto, após muitos estudos com diferentes moléculas antigênicas, até hoje não foi desenvolvido um teste de diagnóstico que seja específico e sensível o suficiente para discriminar as angiostrongilíases de outras parasitoses. A reatividade cruzada tem sido o principal problema encontrado nos estudos já desenvolvidos para este propósito. Com o objetivo de aprimorar o diagnóstico das angiostrongilíases, foi realizado neste estudo análise comparativa do reconhecimento de proteínas de diferentes extratos teciduais de A. cantonensis, Toxocara canis, Schistosoma mansoni e Strongyloides stercoralis contra soro positivo para Angiostrongylus spp Através de kit de extração, eletroforese unidimensional e bidimensional, western blot e espectrometria de massas foram identificadas 149 proteínas. Dentre estas, 34 foram exclusivas para A. cantonensis, sendo que COI estava presente apenas no extrato de A. cantonensis não possuindo similaridades com nenhum outro parasito comparado no NCBI (nr database) e WormBase Database. Estas proteínas podem ser consideradas promissoras como marcadores de reatividade humoral específica para o parasito. Todavia, outras nove proteínas foram reconhecidas por mais de um parasito em mais de um extrato testado, sendo importantes marcadores de reatividade cruzada em infecções parasitárias. Com os dados obtidos neste estudo, sugerimos como marcadores de reatividade cruzada o uso das proteínas: Galectin 1, HSPA-5 e Ifa1. Além disso, proteínas imunogênicas de A. cantonensis ES-7, Lec-5 e 14-3-3, foram expressas de forma recombinante em dois tipos celulares, CHO e HEK, e o potencial uso diagnóstico destas proteínas foi verificado através de eletroforese uni e bidimensional, western e dot blot, e tratamento por N-glycosidase F (PNGase F), utilizando soro positivo para Angiostrongylus spp., soro negativo e positivo para outras parasitoses. Proteína ES-7 expressa em células HEK e CHO, e Lec-5 expressa em CHO foram reconhecidas apenas pelo soro positivo para Angiostrongylus spp. e não pelo soro negativo e controles de especificidade em testes 2D e 1D, respectivamente. Já nas análises em 2D, Lec-5 apresentou fraco reconhecimento com soro negativo. Já a proteína 14-3-3 não apresentou nenhuma especificidade pelo soro de A. cantonensis, já que foi reconhecida por todos os soros testados. O reconhecimento antígeno-anticorpo se mostrou dependente das porções glicídicas, já que quando tratadas com N-glycosidase F (PNGase F), o reconhecimento das proteínas pelo soro desapareceu. A expressão heteróloga, utilizando células de mamíferos, assim como a identificação de moléculas compartilhadas e/ou específicas, podem representar uma promissora fonte de antígenos para o diagnóstico da meningite eosinofílica, requerendo aprimorados testes moleculares para seu diagnóstico.
Abstract (english): Two nematode species belonging to the Metastrongyloidea superfamily are capable to produce disease in humans: Angiostrongylus cantonensis and Angiostrongylus costaricensis. Both are rodent parasites and human infection is considered accidental. Eosinophilic meningoencephalitis, caused by A. cantonensis, raises concern due to the expanding number of cases and geographical area of occurrence. Molecular and immunological methods for the diagnosis are crucial, however, after many studies with different antigenic molecules, has a specific and sensitive test to discriminate the angiostrongyliasis to others parasitoses is lacking. Cross-reactivity with other helminthes, which may cause similar symptoms, and eosinophilic meningitis, has been a problem for the satisfactory performance of specificity in serological tests. In order to improve the diagnosis of angiostrongyliasis, a comparative analysis of protein recognition from different extracts from A. cantonensis, Toxocara canis, Schistosoma mansoni and Strongyloides stercoralis against positive serum for Angiostrongylus.spp was performed. Through extraction kit, one-dimensional and two-dimensional electrophoresis, western blot and mass spectrometry, 149 proteins were identified. Among these, 34 were exclusive to A. cantonensis, COI being present only in the A. cantonensis extract, having no similarities with any other parasite compared in NCBI (nr database) and WormBase Database. Additionally, nine proteins were recognized by more than one parasite and extract, being important cross reactivity markers in parasitic infections. With the data obtained in this study, we suggest the use of the follow proteins as cross-reactivity markers: Galectin 1, HSPA-5 and Ifa1. In addition, immunogenic proteins of A. cantonensis ES-7, Lec-5 and 14-3-3, were recombinant expressed in two cell types, CHO and HEK. Their potential diagnostic values were verified by uni and bidimensional electrophoresis, western and dot blot, and N-glycosidase F (PNGase F) treatment using serum from patients infected with A. cantonensis, negative serum for parasites, and positive for other parasites. ES7 protein expressed in HEK and CHO cells and Lec-5 expressed in CHO were recognized only by Angiostrongylus-positive serum and not by negative control and specificity control in 2D and 1D tests, respectively. In the 2D analyzes Lec-5 showed a weak recognition with negative serum. However, the 14-3-3 protein didn´t show any specificity against A. cantonensis serum, since it was recognized by all tested sera. Antigen-antibody recognition was found to be dependent on the glycogenic portions, since when treated with N-glycosidase F (PNGase F), recognition between proteins and serum disappeared. The heterologous expression, using mammalian cells, as well as the identification of shared and/or specific molecules, may represent a promising source of antigens for the diagnosis of eosinophilic meningoencephalitis, and molecular diagnostic tests become necessary.
Keywords: Angiostrongylus cantonensis
Reatividade Cruzada
Diagnóstico
Proteínas Recombinantes
CNPQ Knowledge Areas: CIENCIAS BIOLOGICAS::ZOOLOGIA
Language: por
Country: Brasil
Publisher: Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul
Institution Acronym: PUCRS
Department: Faculdade de Biociências
Program: Programa de Pós-Graduação em Zoologia
Access type: Acesso Aberto
URI: http://tede2.pucrs.br/tede2/handle/tede/7457
Issue Date: 21-Mar-2017
Appears in Collections:Programa de Pós-Graduação em Ecologia e Evolução da Biodiversidade

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