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Document type: Dissertação
Title: Otimização da tecnologia de fluorescência associada à Reação em Cadeia da DNA Polimerase (PCR em tempo real) para diagnóstico molecular da tuberculose
Author: Assunção, Thiago Milech de 
Advisor: Batista Júnior, Eraldo Luiz
Abstract (native): Nos tempos atuais, os métodos mais utilizados no diagnóstico da Tuberculose (TB) promovem um atraso inaceitável na liberação dos resultados, um elevado número de resultados falso-negativo e muitos não são sensíveis para formas paucibacilares da doença. Este fato se torna crítico uma vez que pacientes infectados continuam não tratados na comunidade aumentando a probabilidade de transmissão da doença e agravo da epidemia, o que corrobora a necessidade de aprimoramento ou desenvolvimento de novas metodologias. Diante deste fato, propusemos implementar um diagnóstico de DNA quantitativo para tuberculose paucibacilar, permitindo uma rápida identificação e quantificação de bacilos viáveis do Mycobacterium tuberculsosis (Mt) em amostras biológicas com o auxílio da PCR em Tempo Real (R-T PCR). A região intergênica do gene inhA-mabA, possui cópia única no genoma do Mt e devido à sua importância na biossíntese de ácidos micólicos, foi escolhida como região alvo para o desenho de primers e sondas específicos acoplados a fluoróforos (TaqMan). A construção de padrões de DNA sintéticos do Mt serviram como referência para a quantificação absoluta dos ácidos nucleicos, com alvo na região intergênica descrita acima. Eles foram amplificados do DNA genômico do Mt utilizando primers específicos, clonados e o DNA plasmidial foi purificado e quantificado para o desenvolvimento de uma curva padrão. Após a morte celular o DNA pode permanecer íntegro; assim, métodos de diagnóstico molecular podem superestimar o número real de células viáveis em uma amostra. Culturas de Mt H37Rv foram tratadas com diferentes concentrações de EMA e PMA, intercalantes de DNA que se ligam no DNA de células mortas tornan-do o insolúvel e desta forma impedindo a sua amplificação. A concentração de 100OM de PMA foi escolhida para tratar amostras de escarro de pacientes em tratamento, ou com suspeita de TB. Nosso método de diagnóstico mostrou uma alta sensibilidade (96,1%) quando comparado a amostras de escarro com baciloscopia positiva e se mostrou 47% mais sensível que a coloração Ziehl-Neelsen para amostras com baciloscopia negativa
Keywords: BIOLOGIA MOLECULAR
TUBERCULOSE - DIAGNÓSTICO
REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE
GENES
DNA
CNPQ Knowledge Areas: CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::BIOLOGIA GERAL
Language: por
Country: BR
Publisher: Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul
Institution Acronym: PUCRS
Department: Faculdade de Biociências
Program: Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular
Citation: ASSUNÇÃO, Thiago Milech de. Otimização da tecnologia de fluorescência associada à Reação em Cadeia da DNA Polimerase (PCR em tempo real) para diagnóstico molecular da tuberculose. 2011. 82 f. Dissertação (Mestrado em Biologia Celular e Molecular) - Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, 2011.
Access type: Acesso Aberto
URI: http://tede2.pucrs.br/tede2/handle/tede/5406
Issue Date: 23-Mar-2011
Appears in Collections:Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular

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