@PHDTHESIS{ 2014:504160553,
 	title = {Análise bioquímica, estrutural e funcional da enzima citidina deaminase (E.C. 3.5.4.5) de Mycobacterium tuberculosis H37Rv},
 	year = {2014},
 	url = "http://tede2.pucrs.br/tede2/handle/tede/5483",
 	abstract = "O agente causador da tuberculose (TB), Mycobacterium tuberculosis, infecta um terço da população mundial. A Organização Mundial da Saúde estima que 8,6 milhões de novos casos de tuberculose ocorreram em 2012, resultando em 1,3 milhões de mortes no mundo. Assim, existe uma necessidade contínua de encontrar alvos moleculares promissores para o desenvolvimento de agentes anti-tuberculose e identificar determinantes de virulência associados com a patogênese de M. tuberculosis, visando a obtenção de cepas mutantes atenuadas como candidatas a novas vacinas contra a tuberculose. As enzimas envolvidas na biosíntese de purina e pirimidina têm papéis importantes no metabolismo celular, uma vez que proporcionam nucleótidos, os quais são componentes essenciais de um grande número de biomoléculas. A enzima Citidina deaminase (CDA) catalisa a desaminação hidrolítica da citidina a uridina, e faz parte da via de salvamento das pirimidinas. A CDA de M. tuberculosis (MtCDA) devido a sua não essencialidade pode ser um alvo interesante para a obtenção de cepas atenuadas para o desenvolvimento de vacinas auxotróficas contra a tuberculose, já que pode estar envolvido nos mecanismos de invasão e latência. No presente trabalho são apresentadas as estruturas cristalográficas da MtCDA em complexo com uridina (2,4 Å de resolução) e deoxiuridina (1,9 Å de resolução). Simulação da Dinâmica Molecular (MD) foi realizada com o propósito de analisar os movimentos fisicamente relevantes envolvidos no processo do reconhecimento proteína-ligante, e mostra que a flexibilidade estrutural de algumas regiões da proteína são importantes para a ligação do produto. Além disso, simulações MD permitiram a análise da estabilidade da estrutura tetramérica da MtCDA. O papel do resíduo conservado glutamato 47 (E47) foi avaliado mediante a construção de cinco proteínas mutantes (E47A, E47D, E47L, E47H, e E47Q). Os mutantes E47A e E47H foram expressos na fração insolúvel, enquanto E47D, E47L e E47Q foram expressas na fração solúvel e purificadas por cromatografia líquida de alta performance (HPLC). Os mutantes E47D, E47L e E47Q continham 1 mol de Zn2+ por mol de subunidade de proteína. Estas mutações não tiveram efeito sobre o estado de oligomerização da MtCDA. Resultados cinéticos em estado estacionário mostraram que os valores de KM para os mutantes E47D e E47Q não foram alterados significativamente, enquanto houve uma redução nos valores de kcat de 37 vezes para E47D e 19 vezes para a mutante E47Q. Não foi detectada qualquer atividade para a mutante E47L. A estrutura cristalográfica do mutante E47D foi resolvida por cristalografia de raios-X o que nos permitiu propor um papel catalítico para o grupo -carboxila do residuo E47, sugerindo o envolvimento de um próton na catálise. Por outro lado, uma parte essencial para o desenvolvimento de novos fármacos e vacinas, é a identificação de produtos de genes que são fundamentais para o crescimento e a sobrevivência bacteriana in vitro e in vivo. Desta forma, foi realizado o nocaute do gene cdd a fim de avaliar a importância deste gene para o crescimento do bacilo em vida livre e em condições de estresse (vida intracelular). Nossos resultados sugerem que o gene cdd não é um gene essencial para o crescimento do bacilo in vitro sob as condições experimentais utilizadas. Experimentos de infecção em camundongos com a cepa nocaute do gene cdd mostraram uma significativa redução nas UFC s determinadas no pulmão e baço dos animais infectados. Con tudo, experimentos de crescimento in vitro e infecção em camundongos estão sendo realizados a fim de confirmar os resultados obtidos. Os resultados da caracterização enzimática e substituição gênica são o ponto de partida para o melhor entendimento sobre o papel da enzima no metabolismo de nucleotídeos em M. tuberculosis, além de abrirem a possibilidade para o desenho racional de uma cepa atenuada, útil para o futuro desenvolvimento de uma nova candidata a vacina contra a tuberculose humana",
 	publisher = {Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul},
 	scholl = {Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular},
 	note = {Faculdade de Biociências}
}