@PHDTHESIS{ 2014:220118708,
 	title = {An?lise bioqu?mica, estrutural e funcional da enzima citidina deaminase (E.C. 3.5.4.5) de Mycobacterium tuberculosis H37Rv},
 	year = {2014},
 	url = "http://tede2.pucrs.br/tede2/handle/tede/5483",
 	abstract = "O agente causador da tuberculose (TB), Mycobacterium tuberculosis, infecta um ter?o da popula??o mundial. A Organiza??o Mundial da Sa?de estima que 8,6 milh?es de novos casos de tuberculose ocorreram em 2012, resultando em 1,3 milh?es de mortes no mundo. Assim, existe uma necessidade cont?nua de encontrar alvos moleculares promissores para o desenvolvimento de agentes anti-tuberculose e identificar determinantes de virul?ncia associados com a patog?nese de M. tuberculosis, visando a obten??o de cepas mutantes atenuadas como candidatas a novas vacinas contra a tuberculose. As enzimas envolvidas na bios?ntese de purina e pirimidina t?m pap?is importantes no metabolismo celular, uma vez que proporcionam nucle?tidos, os quais s?o componentes essenciais de um grande n?mero de biomol?culas. A enzima Citidina deaminase (CDA) catalisa a desamina??o hidrol?tica da citidina a uridina, e faz parte da via de salvamento das pirimidinas. A CDA de M. tuberculosis (MtCDA) devido a sua n?o essencialidade pode ser um alvo interesante para a obten??o de cepas atenuadas para o desenvolvimento de vacinas auxotr?ficas contra a tuberculose, j? que pode estar envolvido nos mecanismos de invas?o e lat?ncia. No presente trabalho s?o apresentadas as estruturas cristalogr?ficas da MtCDA em complexo com uridina (2,4 ? de resolu??o) e deoxiuridina (1,9 ? de resolu??o). Simula??o da Din?mica Molecular (MD) foi realizada com o prop?sito de analisar os movimentos fisicamente relevantes envolvidos no processo do reconhecimento prote?na-ligante, e mostra que a flexibilidade estrutural de algumas regi?es da prote?na s?o importantes para a liga??o do produto. Al?m disso, simula??es MD permitiram a an?lise da estabilidade da estrutura tetram?rica da MtCDA. O papel do res?duo conservado glutamato 47 (E47) foi avaliado mediante a constru??o de cinco prote?nas mutantes (E47A, E47D, E47L, E47H, e E47Q). Os mutantes E47A e E47H foram expressos na fra??o insol?vel, enquanto E47D, E47L e E47Q foram expressas na fra??o sol?vel e purificadas por cromatografia l?quida de alta performance (HPLC). Os mutantes E47D, E47L e E47Q continham 1 mol de Zn2+ por mol de subunidade de prote?na. Estas muta??es n?o tiveram efeito sobre o estado de oligomeriza??o da MtCDA. Resultados cin?ticos em estado estacion?rio mostraram que os valores de KM para os mutantes E47D e E47Q n?o foram alterados significativamente, enquanto houve uma redu??o nos valores de kcat de 37 vezes para E47D e 19 vezes para a mutante E47Q. N?o foi detectada qualquer atividade para a mutante E47L. A estrutura cristalogr?fica do mutante E47D foi resolvida por cristalografia de raios-X o que nos permitiu propor um papel catal?tico para o grupo ?-carboxila do residuo E47, sugerindo o envolvimento de um pr?ton na cat?lise. Por outro lado, uma parte essencial para o desenvolvimento de novos f?rmacos e vacinas, ? a identifica??o de produtos de genes que s?o fundamentais para o crescimento e a sobreviv?ncia bacteriana in vitro e in vivo. Desta forma, foi realizado o nocaute do gene cdd a fim de avaliar a import?ncia deste gene para o crescimento do bacilo em vida livre e em condi??es de estresse (vida intracelular). Nossos resultados sugerem que o gene cdd n?o ? um gene essencial para o crescimento do bacilo in vitro sob as condi??es experimentais utilizadas. Experimentos de infec??o em camundongos com a cepa nocaute do gene cdd mostraram uma significativa redu??o nas UFC s determinadas no pulm?o e ba?o dos animais infectados. Con tudo, experimentos de crescimento in vitro e infec??o em camundongos est?o sendo realizados a fim de confirmar os resultados obtidos. Os resultados da caracteriza??o enzim?tica e substitui??o g?nica s?o o ponto de partida para o melhor entendimento sobre o papel da enzima no metabolismo de nucleot?deos em M. tuberculosis, al?m de abrirem a possibilidade para o desenho racional de uma cepa atenuada, ?til para o futuro desenvolvimento de uma nova candidata a vacina contra a tuberculose humana",
 	publisher = {Pontif?cia Universidade Cat?lica do Rio Grande do Sul},
 	scholl = {Programa de P?s-Gradua??o em Biologia Celular e Molecular},
 	note = {Faculdade de Bioci?ncias}
}