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Please use this identifier to cite or link to this item: http://tede2.pucrs.br/tede2/handle/tede/8906
Document type: Tese
Title: O eixo baço-cérebro na epilepsia experimental e no tratamento com células mononucleares de medula óssea após o status epilépticus
Author: Silva, Daniele Vieira da 
Advisor: Costa, Jaderson Costa da
Abstract (native): A epilepsia, afeta mais de 65 milhões de pessoas em todo o mundo. Recentemente tem sido demostrado que as células mononucleares da medula óssea (CMMO) exercem efeito anti-inflamatório no sistema nervoso central e periférico em estudos com modelos experimentais de epilepsia. Como o baço é um órgão central da imunidade celular e humoral e influencia direta ou indiretamente o sistema nervoso central. No primeiro capítulo investigou-se em animais esplenectomizados, submetidos ao protocolo de pilocarpina e tratados com células mononucleares de medula óssea (CMMO) a biodistribuição das células transplantadas, avaliou-se a expressão de fatores inflamatórios e ainda a memória espacial nos diferentes grupos. Para atender os objetivos, foi utilizado o protocolo de pilocarpina (320mg/kg) para a indução de status epilepticus (SE) em ratos Wistar machos esplenectomizados sete dias antes do SE. As CMMO foram extraídas da medula óssea de ossos longos de camundongos C57Bl/6 transgênicos EGFP+ e a separação foi realizada por gradiente de Ficoll. O transplante de CMMO (100 µL contendo 1x107células EGFP+) foi realizado pela veia da cauda uma hora após o protocolo de pilocarpina nos animais que entraram em SE. Nos tempos de 12 e 24 horas após o transplante os ratos foram eutanasiados para a obtenção de amostras (cérebro, pulmão, fígado, rins e baço). Tanto a biodistribuição das células EGFP+, quanto a expressão dos fatores inflamatórios (Interleucina -1β, TNF-α, AIF-1 e Interleucina-10) foram avaliados com o uso do qRT-PCR. A memória espacial dos animais foi avaliada através do labirinto aquático de Morris (LAM) dez dias após o SE. O resultado deste estudo mostrou que o as células injetadas pela veia da cauda foram encontradas no baço, fígado e rim de animais tratados com o baço e no fígado e rim de animais tratados sem o baço. Vimos ainda que tratamento com as CMMO foi capaz de diminuir as citocinas pró-inflamatórias no tecido cerebral e no baço dos animais submetidos ao SE e também a esplenectomia apresentou um papel anti-inflamatório semelhante ao das CMMO na expressão de citocinas cerebrais nas primeiras 12 horas. No entanto para a terapia com CMMO a esplenectomia nos animais com SE, prejudicou a eficácia do tratamento perante a resposta inflamatória e no teste do LAM, onde os animais tradados e esplenectomizados com SE não desempenharam bem a tarefa proposta no teste. O que reflete em falha na capacidade de aprendizagem e consolidação da memória espacial bem como é vista em ratos com SE sem o tratamento. A partir destes dados, no segundo capítulo, nos propomos a investigar qual o papel do baço no desenvolvimento da epilepsia. O objetivo foi investigar a importância do baço na epileptogênese avaliando a frequência de crises, a memória, o comportamento depressivo e a expressão de fatores inflamatórios no tecido cerebral em dois modelos de epilepsia do lobo temporal (pilocarpina e ácido caínico (KA)). O projeto contou com ratos Wistar machos jovens que foram esplenectomizados sete dias antes dos protocolos de SE (pilocarpina (100mg/kg a cada 30min.) e ácido caínico (KA) (5mg/kg a cada hora). Durante os protocolos de SE, foram avaliadas a latência para a primeira crise, presença de SE, número de crises e mortalidade durante o SE. Na fase crônica da doença (50 dias após o SE) os ratos foram filmados por sete dias (24h/dia). O paradigma do reconhecimento de objetos (RO) foi realizado na semana seguinte ao vídeo monitoramento para testar memória de curta duração. E o teste do nado forçado foi realizado na semana após o RO. A coleta do tecido cerebral para a análise de expressão dos fatores inflamatórios a partir de qRT-PCR foi efetuada após a finalização de todos os testes. Sendo assim, os resultados do nosso segundo estudo revelou que a esplenectomia reduz a latência para primeira crise neste protocolo de pilocarpina e não influenciou na porcentagem de animais com SE, no número de crises e mortalidade durante o SE. Porém no protocolo de KA a esplenectomia aumentou a latência de crises, reduziu a porcentagem de animais que entraram em SE, diminuiu o número de crises e a porcentagem de animais com mortalidade durante o SE. Na fase crônica a frequência de crises não foi alterada pela esplenectomia nos animais dos grupos com pilocarpina e KA. E a duração das crises também não teve diferenciação pela esplenectomia nos dois modelos. A memória de reconhecimento de objetos foi prejudicada nos ratos epilépticos dos dois modelos, entretanto nos ratos epilépticos e esplenectomizados os ratos apresentaram melhor desempenho no teste em ambos os modelos. Todos os ratos epilépticos apresentaram comportamento depressivo perante os resultados do nado forçado e a esplenectomia não mostrou influencia no teste do nado forçado. A expressão de IL-1β e TNF-α em tecido cerebral nos ratos submetidos ao protocolo de pilocarpina foi mais alta em relação aos animais do protocolo de KA e não houve diferença entre os grupos com baço e sem baço. A expressão de AIF-1 foi negativa no tecido cerebral dos ratos de todos os grupos deste estudo. E a expressão em tecido cerebral de IL-10 apresentou um aumento nos ratos epilépticos esplenectomizados nos dois modelos experimentais. Com base nos resultados do nosso estudo foi possível reconhecer que o baço apresenta envolvimento tanto na terapia celular na fase aguda do SE, quanto no processo de epileptogênese nos dois modelos de epilepsia.
Abstract (english): In epilepsy, the most common serious neurological disorder , affects more than 65 million people worldwide. Several investigations in both humans and animals have shown the effectiveness of bone marrow mononuclear cells (BMMC) as a therapy. The role of spleen is to regulate the immune system, as it is the central organ of cellular and humoral immunity and direct or indirectly influences the central nervous system. At the first chapter the objective of this work was to investigate in splenectomized animals, that had undergone the pilocarpine protocol and treated with Bone Marrow Mononuclear Cells (BMMC), the biodistribution of the transplanted cells, to evaluate inflammatory factors expression and spacial memory along the different groups. In order to achieve these objectives, the pilocarpine protocol (320 mg/kg) was used to induce status epilepticus (SE) in male wistar rats that were splenectomized seven days prior to SE. The BMMC were extracted from the Bone Marrow of long bones of C57B1/6 EGFP+ transgenic mice and the separations accomplished through Ficoll gradient. BMMC transplant was performed by injecting a 100 µL suspensions containing 1x107 EGFP+ cells at the tail vein of animals that presented SE one hour after the pilocarpine protocol. 12 and 24 hours after the cell transplant animals were euthanized for brain, lung, liver, kidneys and spleen sampling. Both EGFP+ cells biodistribution and inflammatory factors expression (Interleukin 1β, TNF-α, AIF-1 and Interleukin 10) were assessed through qRT-PCR. Spacial memory was assessed through Morris Water Maze (MWM) ten days after SE. The result of this first study demonstrated that cells injected at the tail vein were found in the spleen. We further found that BMMC treatment was capable of diminishing pro-inflammatory cytokines at brain and spleen tissues of animals submitted to SE. Also splenectomy played an anti-inflammatory role similar to the BMMC transplant at brain cytokines expression throughout the first 12 hours. However splenectomy seemed to have impaired BMMC therapy on animals submitted to SE. Splenectomized animals developed more inflammation and did worse on MWM test. These findings suggest failure on learning and spacial memory consolidation abilities as seen on SE animals without BMMC treatment. From these data we proposed to investigate the spleen’s role on epilepsy development. The objective of the second study was to investigate the importance of the spleen in epileptogenesis evaluating crysis frequency, memory, depressive behavior and brain tissue inflammatory factors expression in two temporal lobe epilepsy models (pilocarpine and kainic acid (KA)). For this project male Wistar rats were splenectomized seven days before pilocarpine (100 mg/kg) and KA (5 mg/kg per hour) SE protocols. During SE protocols the first crysis latency, SE presence and number of deaths were evaluated. At the chronic phase (50 days after SE), rats were filmed 24 h/day during seven days. The object recognition paradigm (OR) was performed one week next to video monitoring to evaluate short term memory. The forced swimming test was carried out one week after OR. Brain tissues were sampled for inflammatory factor expression analysis assays from qRT-PCR after all tests were finished. Therefore, data from our second study revealed that splenectomy reduced the latency to the first seizure in this pilocarpine protocol and did not influence at the percentage of SE animals, number of seizures and mortality during SE. However, in KA protocol splenectomy seemed to increase both seizure latency and the mortality percentage during SE. At chronic phase, seizure frequency was not modified by splenectomy in both pilocarpine and KA groups. Seizure duration remained unchanged by splenectomy in both models. Object recognition memory was impaired on SE animals from both protocols, though splenectomized animals showed better performance at this memory task in both protocols. On forced swimming test, epileptic animals displayed depressive-like behavior and splenectomy did not influence forced swimming results. IL-1β and TNF-α expression levels on brain tissue from SE rats that underwent the pilocarpine protocol was higher when compared to those animals from KA protocol and no difference was observed among groups with and without spleen. AIF-1 expression on brain tissue was negative on rats from all the studied groups. And the brain tissue expression of IL-10 was higher on epileptic splenectomized animals from both SE models. Based on the results of our study it was possible to understand that the spleen plays a role not only on cellular therapy and acute SE phase but also on the epileptogenic process on both epilepsy models.
Keywords: Baço
Cérebro
Epilepsia
Inflamação
Memória
CNPQ Knowledge Areas: CIENCIAS DA SAUDE::MEDICINA
CLINICA MEDICA::NEUROLOGIA
Language: por
Country: Brasil
Publisher: Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul
Institution Acronym: PUCRS
Department: Escola de Medicina
Program: Programa de Pós-Graduação em Medicina/Pediatria e Saúde da Criança
Access type: Acesso Aberto
Fulltext access restriction: Trabalho será publicado como artigo ou livro
Time to release fulltext: 60 meses
Date to release fulltext: 02/10/2024
URI: http://tede2.pucrs.br/tede2/handle/tede/8906
Issue Date: 28-Mar-2019
Appears in Collections:Programa de Pós-Graduação em Pediatria e Saúde da Criança

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