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Document type: Dissertação
Title: Caracterização bioquímica da enzima Adenilosuccinato liase de Leishmania (Viannia) braziliensis visando o planejamento racional de fármacos antileishmanioses
Author: Galina, Luiza 
Advisor: Basso, Luiz Augusto
Abstract (native): A enzima Adenilosuccinato liase (ASL) pertence a superfamília de enzimas aspartase/fumarase, as quais compartilham o mecanismo catalítico ácido-básico com β-eliminação de fumarato como o produto comum. A ASL está envolvida tanto na biossíntese de novo quanto na via de salvamento de purinas. Aqui são descritos os métodos de clonagem, expressão e obtenção da proteína recombinante ASL de Leishmania braziliensis (LbASL) na sua forma homogênea. Análises da proteína recombinante por espectrometria de massa, determinação do estado oligomérico e alinhamento múltiplo de sequências também são apresentados. Ensaios de cinética em estado estacionário mostraram que a LbASL segue o perfil de Michaelis-Menten. Experimentos de titulação isotérmica por calorimetria sugerem que a LbASL segue um mecanismo cinético Uni-Bi ordenado, no qual o fumarato é liberado primeiro do sítio ativo seguido pelo AMP. Dados de velocidade iniciais para a reação reversa e a relação de Haldane permitiram calcular uma constante de equilíbrio desfavorável para a reação química catalisada pela enzima. Os parâmetros de energia de ativação e termodinâmica também foram estimados. Os efeitos isotópicos do solvente V/K e V sugerem uma modesta contribuição da transferência de prótons do solvente durante o passo limitante da reação. Os dados obtidos no inventário de prótons mostram um modesto efeito em V resultante de um único sítio protônico, e o valor de transição do fator de estado de fracionamento de 0,74 sugere a participação da transferência de prótons do solvente em vibrações de estado de transição perpendiculares à coordenada da reação. Experimentos de perfil de pH para kcat e kcat/KM sugerem os resíduos de aminoácidos envolvidos, respectivamente, na catálise e ligação do substrato. A modelagem molecular para LbASL foi realizada visando prover uma base estrutural para interpretação dos dados experimentais. Um melhor entendimento do modo de ação da LbASL será útil para o desenho racional de agentes antileishmanioses.
Abstract (english): Adenylosuccinate lyase (ASL) belongs to aspartase/fumarase superfamily of enzymes which share a general acid-base catalytic mechanism with β-elimination of fumarate as common product. ASL is involved in both de novo and salvage pathways of purine biosynthesis. Cloning, expression, and a method to obtain homogeneous recombinant ASL from Leishmania braziliensis (LbASL) are described. Mass spectrometry analysis of recombinant LbASL, oligomeric state determination and multiple sequence alignment are presented. Steady-state kinetics of LbASL showed a Michaelis-Menten pattern. Isothermal titration calorimetry binding assays suggested that LbASL follows a Uni-Bi ordered kinetic mechanism, in which release of fumarate is followed by AMP to yield free enzyme. Initial velocity data for the reverse reaction and the Haldane relationship allowed calculation of an unfavorable equilibrium constant for LbASL-catalyzed chemical reaction. The activation energy and thermodynamic activation parameters were estimated. Solvent kinetic isotope effects V/K and V suggest a modest contribution of solvent proton transference during the rate-limiting step of the reaction. Proton inventory data show that the modest normal effect on V arises from a single protonic site, and the transition state fractionation factor value of 0.74 suggests participation of solvent proton transfer in transition-state vibrations perpendicular to the reaction coordinate. pH-rate profiles for kcat and kcat/KM suggested amino acid residues involved in, respectively, catalysis and substrate binding. A model of LbASL was built to provide a structural basis for the experimental data. A better understanding of the mode of action of LbASL is useful for the rational design of antileishmaniasis agents.
Keywords: Leishmania Braziliensis
Salvamento de Purinas
Adenilossucinato Liase
Caracterização Bioquímica
Leishmaniose Cutânea
CNPQ Knowledge Areas: CIENCIAS BIOLOGICAS::BIOLOGIA GERAL
Language: por
Country: Brasil
Publisher: Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul
Institution Acronym: PUCRS
Department: Faculdade de Biociências
Program: Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular
Access type: Acesso Aberto
Fulltext access restriction: Trabalho não apresenta restrição para publicação
URI: http://tede2.pucrs.br/tede2/handle/tede/7755
Issue Date: 26-Oct-2017
Appears in Collections:Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular

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