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Tipo do documento:	Dissertação
Título:	Amplificação, clonagem, superexpressão e purificação da enzima citidina deaminase (Cdd, E.C.3.5.4.5) de Mycobacterium tuberculosis
Autor:	Quitian, Zilpa Adriana Sánchez
Primeiro orientador:	Santos, Diógenes Santiago
Resumo:	A tuberculose (TB) é considerada uma ameaça à saúde pública mundial; segundo a Organização Mundial da Saúde, cerca de dois milhões de pessoas morrem anualmente em conseqüência desta doença. Uma das características mais importantes do patógeno causador da TB é a sua capacidade de persistir nos tecidos do hospedeiro por um longo período em um estado de latência, também conhecido como persistência. A importância do estado de latência à sobrevivência do bacilo tem sido um atrativo fator para o desenvolvimento de trabalhos que caracterizem com maior profundidade esta fase da infecção por M. tuberculosis. O entendimento do modo de ação e o papel das enzimas da rota de salvamento de pirimidinas em M. tuberculosis poderia revelar novos alvos para o desenho racional de agentes anti-TB potentes e seletivos capazes de, se possível, prevenir a progressão e a reativação da doença. A citidina deaminase (CDA, EC 3.5.4.5), uma enzima evolutivamente conservada da rota de salvamento das pirimidinas, catalisa a deaminacao hidrolítica de citidina e 2'-desoxicitidina para formar uridina e 2'-desoxiuridina, respectivamente. O provável gene da CDA (cdd, Rv3315c) de M. tuberculosis foi clonado, seqüenciado e expresso em células de Escherichia coli BL21(DE3). O protocolo de purificação da CDA recombinante de M. tuberculosis (MtCDA) produziu 35 mg de proteína homogênea a partir de 10 g de células. A análise de espectrometria de massas, seqüenciamento N-terminal e cromatografia por gel filtração confirmaram a massa molecular prevista, a identidade e o estado oligomérico de MtCDA, que foi estimada em 52,99 kDA. Estes resultados e os de alinhamento múltiplo de seqüências sugere que MtCDA é um homotetrâmero em solução. Medidas de cinética em estado estacionário da CDA geraram os seguintes parâmetros: valores de KM e kcat de, respectivamente, 1004 uM e 4,8 s-1 para citidina, e 1059 uM e 3,5 s-1 para 2'- desoxicitidina. A dependência dos valores de kcat e kcat/KM em função do pH para citidina indicam que a protonação de um único grupo ionizável com valor de pKa de 4,3 elimina a atividade, e a protonação de um grupo com pKa de 4,7 reduz a ligação ao substrato. Foram obtidos cristais de CDA utilizando o método de difusão de vapor em gota pendente. A demonstração de que o locus Rv3315c codifica uma proteína com atividade CDA em M. tuberculosis é o primeiro passo para entender o papel do produto deste gene e deverá ajudar no desenho de agentes anti-TB e vacinas.
Palavras-chave:	BIOLOGIA MOLECULAR ENZIMAS TUBERCULOSE
Área(s) do CNPq:	CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::BIOQUIMICA::BIOLOGIA MOLECULAR
Idioma:	por
País:	BR
Instituição:	Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul
Sigla da instituição:	PUCRS
Departamento:	Faculdade de Biociências
Programa:	Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular
Citação:	QUITIAN, Zilpa Adriana Sánchez. Amplificação, clonagem, superexpressão e purificação da enzima citidina deaminase (Cdd, E.C.3.5.4.5) de Mycobacterium tuberculosis. 2009. 68 f. Dissertação (Mestrado em Biologia Celular e Molecular) - Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, 2009.
Tipo de acesso:	Acesso Aberto
URI:	http://tede2.pucrs.br/tede2/handle/tede/5337
Data de defesa:	23-Mar-2009
Aparece nas coleções:	Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular

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